Персонализация (восстановление) микробиоты донорского грудного молока с помощью материнского грудного молока

Персонализация (восстановление) микробиоты донорского грудного молока с помощью материнского грудного молока

Преимущества использования донорского молока для недоношенных детей включают иммунную и пищевую защиту от инфекций, снижение частоты некротизирующего энтероколита (НЭК) и других заболеваний (Wight, 2001). В отсутствие материнского грудного молока (МГМ) Американская академия педиатрии рекомендует для сильно недоношенных детей и экстремально недоношенных детей отдавать приоритет использованию ДГМ вместо смесей (Moretti, 2012 ). Так, текущая практика в отделении интенсивной терапии новорожденных (NICU) медицинского центра «UF Health» в городе Джексонвилл штат Флорида, заключается в предоставлении ДГМ недоношенным детям гестационного возраста менее 30 недель, если запас МГМ мал или молоко отсутствует.

Анализ микробиомов, проведенный учёными, показал, что существует персонализированный набор микроорганизмов в грудном молоке каждой матери, который оптимизирован для здоровья ее собственного ребенка. И с помощью восстановления живой микрофлоры донорского грудного молока (ДГМ) можно передавать содержащиеся там полезные микроорганизмы младенцам. 

Донорское грудное молоко, используемое в большинстве отделений интенсивной терапии новорожденных, пастеризуется из соображений безопасности ( Landers and Updegrove, 2010 ). Пастеризация ДГМ убивает 99% бактерий, а также может деактивировать большую часть биологически активных компонентов в грудном молоке. Поскольку донорское молоко разных доноров объединяют и пастеризуют, ему не хватает уникального живого материнского молочного микробиома, который может быть полезен для конкретного недоношенного младенца (обзор Jost et al., 2015). 

Большинство матерей сильно недоношенных детей могут вырабатывать небольшое количество собственного молока, и, хотя его может быть недостаточно для удовлетворения ежедневных потребностей своего ребенка в питательных веществах, оно все равно может обеспечить долговременную пользу для здоровья ребёнка. Цель учёных состояла в том, чтобы побудить матерей, чьи дети находятся в отделении интенсивной терапии, продолжать сцеживание и использовать небольшое количество материнского грудного молока (МГМ) для инокуляции пастеризованного донорского грудного молока, чтобы добавить в него потенциально полезные, встречающиеся в грудном молоке, микроорганизмы. 

Ученые предположили, что свежее МГМ может быть смешано с ДГМ для улучшения качества ДГМ путем культивирования полезного молочного микробиома. Были проведены исследования для определения оптимальных разведений и времени инкубации для получения микрофлоры, наиболее похожей на микрофлору МГМ. В результате подсчета жизнеспособных бактерий и анализа микробиомов, можно сделать вывод, что ДГМ, инкубированный 10-30 % МГМ в течение 4 часов, является оптимальной стратегией восстановления микробиома.

МГМ содержит незаменимые иммуномодулирующие факторы, включая комменсальные бактерии (тренирующие иммунную систему младенца) ( Wold and Adlerberth, 2002 ; Jost et al., 2013 ). Отмечается, что кормление недоношенных детей МГМ уменьшает НЭК и сепсис даже при небольших количествах МГМ, обеспечивающих частичную защиту ( Furman et al., 2003 ; Schanler, 2005 ; Meinzen-Derr et al., 2009 ; Corpeleijn et al., 2012 , 2016 ; Abrams et al., 2014 ; Chowning et al., 2016). Микробиом, обнаруженный в МГМ, может обеспечить краткосрочные и долгосрочные преимущества для детей, в том числе предотвращение колонизации патогенными микроорганизмами и создание здоровой кишечной микрофлоры, которая может препятствовать долгосрочным заболеваниям, включая ожирение, диабет 2 типа, хроническое воспаление кишечника, аутоиммунные расстройства, аллергию, синдром раздраженного кишечника и аллергический гастроэнтерит ( Goulet, 2015 ; Lemas et al., 2016 ; Wallace et al., 2016 ). 

К сожалению, многие матери недоношенных детей не могут вырабатывать достаточное количество грудного молока для удовлетворения 100% потребностей своего ребенка в питании ( Smith et al., 2003 ; Lee and Gould, 2009). Восстановленная микробиота может послужить персонализированной и выгодной альтернативой ДГМ, в случае недостаточности МГМ. Поскольку МГМ содержит уникальный микробиом ( Hunt et al., 2011 ; Cacho и Neu, 2014 ), обеспечение им младенцев может быть ценным, в особенности для недоношенных новорожденных с риском инфекций и других специфических заболеваний недоношенных.

Исследовательская когорта состояла из двенадцати матерей, которые предоставили образцы грудного молока в период с декабря 2014 года по февраль 2016 года. Это были матери, которые родили ребенка при сроке беременности менее 32 недель, весом менее 1500 г и сцеживали более 100 мл грудного молока в день и не менее 45 мл за каждый сеанс сцеживания. Из исследования исключали матерей, которые родили ребенка с хромосомной аномалией или которые были серьезно больны, и матерей, которые в тот момент принимали антибиотики.

Каждая мать сцеживала одну пробу грудного молока объемом 45 мл (МГМ) в стерильный контейнер, используя клинический молокоотсос (Symphony Breast Pump, Medela LLC) и новый набор для молокоотсоса (Symphony Breast Pump Kit, Medela LLC). Перед сбором образцов матерям были даны устные инструкции относительно гигиены рук во время сцеживания молока и методики обработки молокоотсоса согласно протоколу NICU. Сразу после сбора образцы были помещены на лёд и доставлены в лабораторию для обработки. Пастеризованное ДГМ было получено в замороженном виде из Северо-американской Ассоциации банков донорского молока (HMBANA) (см. http://rmchildren.org/mothers-milk-bank/donate-milk/collection-and-storage/ - руководство по сбору молока для доноров) и размораживалось непосредственно перед каждым процессом восстановления микробиоты.

Стратегия восстановления заключалась в добавлении различных объемов материнского грудного молока (МГМ) в пастеризованное донорское молоко ДГМ в соотношении 1, 5, 10 и 30%. После смешивания молоко выдерживали при 37°С. Образцы отбирали в разные моменты времени – сразу же, через 4 часа и через 8 часов. Для подсчета жизнеспособных бактерий образцы анализировали сразу же. Для анализа микробиома 2 мл сепарировали при 12000 об/мин в течение 5 минут при 4°С. То, что всплывало наверх (надосадочная жидкость), удаляли, а осадок хранили при -80°С до момента выделения (извлечения) ДНК. Кислотность и внешний вид образцов в каждый момент времени также были зарегистрированы.

Результаты показали, что из грудного молока можно культивировать:

• стафилококки
• факультативные аэробы
• молочнокислые бактерии
• немного грамотрицательных бактерий.

Небольшие количества грамотрицательных бактерий в грудном молоке могут быть важны для подготовки иммунной системы к использованию механизмов толерантности для предотвращения чрезмерной реакции на будущие грамотрицательные бактерии (Madara, 2004 ).

Учёным не удалось выделить Bifidobacterium в культуре, что может быть связано с чувствительной анаэробной природой Bifidobacterium и тем, что не были созданы надлежащие анаэробные условия или методы, содействующие росту. Кроме того, возможно, что Bifidobaceterium имеет незначительную долю в грудном молоке матерей, родивших недоношенных детей, согласно исследованию Khodayar-Pardo et al. (2014), которое показало меньшее содержание Bifidobacterium по сравнению с молоком матерей доношенных детей.

Также исследования грудного молока показывают, что богатое разнообразие микроорганизмов поддерживается в здоровой молочной железе, а у матерей, например, с маститом преобладают виды Staphylococcus или Streptococcus (Delgado et al., 2008).

Отмечается, что способ родов влияет на микробиоту грудного молока. Согласно большинству исследований, существует разница в микробиоме молока у детей, рожденных с помощью кесарева сечения, и у детей, рожденных вагинально ( Azad et al., 2013 ; Gregory et al. , 2015 ; Liu et al., 2015 ; Brumbaugh et al., 2016 ; Dominguez-Bello et al., 2016 ; Lee и др., 2016 ; Nagpal et al., 2016 ; Rutayisire et al., 2016):

• виды бактерий, наиболее распространенные в грудном молоке при вагинальных родах: Halomonas, Lactobacillus, Prevotella, неклассифицированный род Clostridiaceae, Clostridium, Comamonas и Dorea.
• виды бактерий, наиболее распространенные в грудном молоке матерей после кесарева сечения: Erwinia, Pseudomonas, Ruminococcus , неклассифицированный род Enterococcaceae, Agrobacterium, Citrobacter, Enterococcus, Klebsiella, неклассифицированный род Bacilli, неклассифицированный род Bradyrhizobiaceae и неклассифицированный род Methylophilaceae.

Остальные виды бактерий варьируются у каждой матери, независимо от способа родов, что подтверждает индивидуальность микробиоты.

На основании полученных результатов восстановление живого микробиома ДГМ с помощью МГМ представляется перспективным и инновационным методом обеспечения недоношенных детей полезными бактериями грудного молока. 

Хорошо известно, что грудное молоко изменяется со временем, чтобы удовлетворить специфические потребности младенцев, которые связаны с этапами лактации, гестационного возраста, состояния здоровья диады мама-ребенок ( Daly et al., 1996 ; Kent, 2006 ;  Hassiotou et al., 2013). Если матери недоношенных детей способны вырабатывать даже минимальное количество грудного молока, восстановление микробиома в ДГM может позволить их детям получать молоко, более подходящее для их индивидуальных потребностей, что потенциально может улучшить их общее состояние и здоровье. 

Основным ограничением данного исследования является небольшой размер выборки и использование антибиотиков в течение перипартального периода. Тем не менее, в нем рассматривается концепция, согласно которой живая микробиота в донорском молоке может быть эффективно восстановлена с помощью материнского грудного молока.  Матерям не требовалось очищать грудь до взятия проб грудного молока, поэтому в их пробах мог содержаться более высокий уровень микробов, размножающихся на коже. Еще одним ограничением исследования является то, что не были оценены факторы внешней среды. Будущие исследования должны будут включать анализ потенциальных патогенных бактериальных групп, которые могут размножаться в образцах восстановленной микробиоты донорского молока в среде Отделения интенсивной терапии новорожденных.

Учёные показали, что у каждой матери есть уникальная микробиота молока и что живой микробиом в донорском молоке может быть восстановлен с помощью уникальных бактерий из небольшого количества МГМ. Это новый подход к возможному улучшению биологической активности ДГМ путем добавления определенных микроорганизмов грудного молока в небольших количествах. Персонализация ДГМ может принести пользу диаде мать-ребенок и способствовать выработке более устойчивой кишечной микрофлоры у детей. Подсчет жизнеспособных бактерий и анализ микробиомов показывает, что ДГМ, инкубированное 10 процентами МГМ в течение 4 часов, является оптимальной стратегией восстановления микробиома. И даже инокуляция с количеством МГМ в объеме всего 1% может заселить ДГМ потенциально полезными бактериями молока матери.

Финансирование этого исследования было предоставлено Medela, AG.

Заявление о конфликте интересов

По заявлению авторов, исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список благодарностей

Авторы хотели бы поблагодарить матерей, которые щедро предоставили образцы молока для исследования. Мы выражаем признательность нашим специальным сестрам по уходу за новорожденными за отличную заботу о наших пациентах. Мы также благодарим Кристофера Гарднера и Тару Миллер за их техническую помощь. Наконец, мы выражаем признательность компании Medela за поставку новых стерильных насосных наборов, используемых в этом исследовании.